مقاله بهینه سازی پپتید MIG6segment2 برای هدف گیری EGFR (سال 2016 الزویر)

1- مقدمه

2.3- پویش محاسباتی آلانین

2.4- تست اتصال

3- نتایج و بحث

Human epidermal growth factor receptor (EGFR) plays a central role in the pathological progression and metastasis of lung cancer; the development and clinical application of therapeutic agents that target the receptor provide important insights for new lung cancer therapies. The tumor-suppressor protein MIG6 is a negative regulator of EGFR, which can bind at the activation interface of asymmetric dimer of EGFR kinase domains to disrupt dimerization and then inactivate the kinase (Zhang X. et al. Nature 2007, 450: 741–744). The protein adopts two separated segments, i.e. MIG6segment 1 and MIG6segment 2 , to directly interact with EGFR. Here, computational modeling and analysis of the intermolecular interaction between EGFR kinase domain and MIG6segment 2 peptide revealed that the peptide is folded into a twostranded b-sheet composed of b-strand 1 and b-strand 2; only the b-strand 2 can directly interact with EGFR activation loop, while leaving b-strand 1 apart from the kinase. A C-terminal island within the b-strand 2 is primarily responsible for peptide binding, which was truncated from the MIG6segment 2 and exhibited weak affinity to EGFR kinase domain. Structural and energetic analysis suggested that phosphorylation at residues Tyr394 and Tyr395 of truncated peptide can considerably improve EGFR affinity, and mutation of other residues can further optimize the peptide binding capability. Subsequently, three derivative versions of the truncated peptide, including phosphorylated and dephosphorylated peptides as well as a double-point mutant were synthesized and purified, and their affinities to the recombinant protein of human EGFR kinase domain were determined by fluorescence anisotropy titration. As expected theoretically, the dephosphorylated peptide has no observable binding to the kinase, and phosphorylation and mutation can confer low and moderate affinities to the peptide, respectively, suggesting a good consistence between the computational analysis and experimental assay.

رسپتور فاکتور رشد اپیدرمی انسانی (EGFR) یک نقش مهم را در پیشرفت بیماری و متاستاز سرطان ریه بازی می کند؛ پیشرفت و کاربرد بالینی عوامل درمانی که این رسپتور را هدف می گیرند بینش مهمی را نسبت به درمان های جدید سرطان ریه فراهم می کنند. پروتئین مهار کننده ی تومور MIG6 یک تنظیم کننده ی منفی برای EGFR می باشد که می تواند به وجه درونی فعال سازی دایمر نامتقارن دمین های EGFR کیناز باند شود تا دایمری شدن را مختل کند و سپس کیناز را غیرفعال کند (Zhang X, et al., Nature 2007, 450: 741-744). پروتئین دو بخش مجزا را می پذیرد یعنی MIG6segment 1 و MIG6segment 2، تا به طور مستقیم با EGFR برهم کنش کند. بنابراین، مدل سازی محاسباتی و آنالیز تعامل بین مولکولی بین دمین EGFR کیناز و پتید MIG6 segment 2 نشان می دهد که این پپتید به یک صفحه ی بتا دو رشته ای فولد می-شود که ترکیبی از رشته بتا 1 و رشته بتا 2 می باشد؛ فقط رشته بتا 2 می تواند به طور مستقیم با لوپ فعال سازی EGFR برهم کنش کند در حالی که رشته بتا 1 باقی مانده از کیناز جدا می شود. یک جزیره C ترمینال درون رشته 2 بتا در درجه اول مسئول اتصال به پپتید می باشد که از MIG6 segment 2 برش می خورد و تمایل ضعیفی را برای دمین EGFR کیناز نشان می دهد. آنالیز ساختاری و انرژیک پیشنهاد می کند فسفریلاسیون در رزیدوهای تیروزین 394 و تیروزین 395 پپتید برش خورده می تواند به طور قابل توجهی تمایل EGFR را بهبود ببخشد، و موتاسیون سایر رزیدوها می تواند ظرفیت اتصال پپتید را بیشتر بهینه کند. سپس 3 نسخه ی مشتق شده از پپتید برش خورده، از جمله پپتیدهای فسفریله شده و دفسفریله شده و همچنین یک جهش یافته ی دو نقطه ای سنتز و تخلیص شدند و تمایل آن ها به پروتئین نوترکیب دمین کیناز EGFR انسانی توسط تیتراسیون آنیزوتروپی فلوئورسنت تعیین شد. همانطوری که از نظر تئوری انتظارش می رفت، پپتید دفسفریله شده هیچ اتصال قابل مشاهده ای به کیناز ندارد و فسفریلاسون و موتاسیون می تواند تمایل پایین تا متوسطی را برای پپتید ارائه کند که نشان می دهد یک سازگاری خوب بین آنالیز محاسباتی و بررسی آزمایشگاهی وجود دارد.