مقاله کشت های ریشه مویین و باززایی گیاه در Solidago nemoralis ترنسفورم شده (2013 Scirp)

1.مقدمه

2. مواد و روش ها

2.1. مواد گیاهی و شرایط کشت

2.2. کشت آگروباکتریوم و آلوده سازی

2.3. باززایی گیاه از ریشه های مویین

2.4. روش هیستوشیمیایی P- گلوکورونیداز (GUS)

3. نتایج

4. بحث

By screening a native plant extract library we identified Solidago nemoralis as a novel source of agonists for alpha7 nicotinic receptors for acetylcholine with therapeutic potential. The next phase of our drug discovery strategy is to increase the yields of active compounds in the plant species by gain of function mutations in hairy root cultures [1]. Here we report a protocol for Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation of hairy root cultures of Solidago nemoralis which will enable this. Leaf explants of this species were successfully transformed with a frequency of 30% – 35% using A. rhizogenes strain R1000 harboring the binary vector pCambia 1301. Transformation was confirmed using the β-glucuronidase (GUS) histochemical assay. Transformed hairy roots showed spontaneous regeneration of adventitious shoots in media without the addition of cytokines, albeit at very low frequency. However, media supplementation with auxin (α-naphthaleneacetic acid, NAA) increased shoot regeneration frequency to 35% and resulted in viable adventitious shoots. Transformation was confirmed at all phases of plant regeneration by GUS staining. Hairy root transformation of Solidago altissima has been previously reported, but this is the first report of genetic transformation of S. nemoralis. The protocol will allow for a large population of activation tagged mutants of S. nemoralis to be generated which will be then screened for the presence of stable mutants which are over-producing metabolites with activity at alpha7 nicotinic receptors. These over-producing mutant cultures will then be regenerated into intact mutant plants.

با غربالگری کتابخانه ی عصاره های گیاهی بومی، Solidago nemoralis به عنوان یک منبع جدید آگونیست گیرنده های نیکوتینی alpha7 استیل کولین با پتانسیل درمانی شناخته شد. مرحله بعدی استراتژی کشف دارو، افزایش بازده ترکیبات فعال در گونه های گیاهی با پیشرفت جهش عملکردی در کشت ریشه مویین است [1]. در اینجا یک پروتکل برای تراریخت کردن ژنتیکی کشت های ریشه های مویین Solidago nemoralis با واسطه ی آگروباکتریوم ریزوژنس گزارش شده است. ریزنمونه های برگی این گونه به طور موفق با فراوانی 30٪ – 35٪ با استفاده از آگروباکتریوم ریزوژنس سویه ی R1000 دارای ناقل pCambia 1301 تراریخت شد. تراریخت سازی با استفاده از روش هیستوشیمی بتا-گلوکورونیداز (GUS) تایید شد. در ریشه های مویین تراریخت، بازسازی خود به خودی شاخه های نابجا در محیط بدون افزودن سیتوکین ها، البته در فراوانی خیلی کم مشاهده شد. با این حال، افزودن اکسین به محیط (آلفا –نفتالن استیک اسید، NAA) باعث افزایش فراوانی بازسازی ساقه ها تا 35٪ و در نتیجه ایجاد شاخه های نایه جای قابل دوام شد. تراریخت سازی در تمام مراحل باززایی گیاه از طریق رنگ آمیزی GUS تایید شد. تراریخت سازی ریشه مویین Solidago altissima قبلا گزارش شده، اما این اولین گزارش از تراریخت سازی ژنتیکی S. nemoralis است. این پروتکل باعث فعال سازی موتانت های برچسب دار در جمعیت بزرگی از S. nemoralis شده که به نوبه خود از نظر حضور موتانت های پایدار غربال شدند که این موتانت ها باعث تولید بیش از حد متابولیت های فعال در گیرنده های نیکوتینی آلفا7 می شوند. پس از این، کشت های این موتانت ها به گیاهان موتانت دست نخورده بازسازی شدند.