مقاله اگزوپلی فسفاتاز موجود در سودوموناس آئروژینوزا برای تولید فاکتورهای ویرولانسی (2013 MicrobiologyResearch)

مقدمه

روش‌ها

سویه‌های باکتریایی، پلاسمیدها و شرایط رشد

تست بیوفیلم

تست حرکت

تست درک حد نصاب (کروم سنسینگ)

تست‌های تولید پیوسیانین و پیووردین

تولید رامنولیپید

متدولوژی DNA

ساخت پلاسمیدهای حاوی ناحیه پروموتور اصلی ژن ppx

بیان بیش از حد و تخلیص NtrC جهش یافته در سودوموناس آئروژینوزا

مطالعات مربوط به اتصال DNA

آنالیز آماری

آنالیز بیوانفورماتیکی

نتایج

اثرات جهش‌های نول ژن ppx بر روی فاکتورهای ویرولانس

بقا در محیط فاقد اورتوفسفات

رشد بیوفیلم و تولید رامنولیپید

بیوسنتز خود القاکننده

شنا کردن و حرکت هجومی

رنگدانه‌های آبی/ سبز خارج سلولی

بیان ژن ppx تحت شرایط مختلف تنش غذایی

اثر منابع کربن و نیتروژن بر روی بیان ژن ppx در سودموناس آئروژینوزا سویه PAO1

اثر غلظت‌های مختلف اورتوفسفات بر بیان ppx

سازماندهی رونویسی ژن ppx در سودوموناس آئروژینوزا سویه PAO1

شناسایی موتیف‌های عملکردی در ناحیه تنظیم‌کننده ژن ppx

نقشه‌برداری جایگاه شروع رونویسی (TSS).

تعیین توالی حداقلی DNA برای بیان ppx و اهمیت هر یک از نواحی تنظیمی

اثر توالی‌های بالادست مختلف بر روی بیان ppx.

بحث

The exopolyphosphatase (Ppx) of Pseudomonas aeruginosa is encoded by PA5241 gene (ppx). Ppx catalyzes the hydrolysis of inorganic polyphosphates (polyPs) to orthophosphate (Pi). In the present work we identified and characterize the promoter region of ppx and its regulation under environmental stress conditions. The role of Ppx in the production of several virulence factors was demonstrated through studies performed on a ppx null mutant. We found that ppx is under the control of two interspaced promoters, dually regulated by nitrogen and phosphate limitation. Under nitrogen-limiting conditions its expression was controlled from a σ 54-dependent promoter activated by the response regulator NtrC. On the other hand, under Pi limitation the expression was controlled from a σ 70 promoter, activated by PhoB. Results obtained from the ppx null mutant demonstrate that Ppx is involved in the production of virulence factors associated with both acute infection (e.g., motility-promoting factors, blue/green pigment production, C6-C12 quorum-sensing homoserine lactones) and chronic infection (e.g., rhamnolipids, biofilm formation). Molecular and physiological approaches used in this study indicate that P. aeruginosa consistently maintains proper levels of Ppx regardless of environmental conditions. The precise control of ppx expression appears to be essential for the survival of P. aeruginosa and the ocurrence of either acute or chronic infection in the host.

اگزوپلی فسفاتاز (Ppx) موجود در سودوموناس آئروژینوزا توسط ژن PA5241 (ppx) کد می‌شود. Ppx هیدرولیز پلی‌فسفات‌های معدنی (polyPs) به اورتوفسفات (Pi) را کاتالیز می‌کند. در پژوهش حاضر ما ناحیه پروموتور ppx و تنظیم آن تحت شرایط‌ تنش زیست محیطی را تعریف و مشخص کردیم. نقش Ppx در تولید فاکتورهای ویرولانسی مختلف از طریق مطالعات انجام شده بر روی جهش‌یافته نول ppx نشان داده شد. ما به این موضوع پی‌بردیم که ppx تحت کنترل دو پروموتور جداگانه که هر دو توسط محدودیت‌های نیتروژن و فسفات تنظیم می‌شوند؛ قرار دارد. تحت شرایط محدودکننده نیتروژن، بیان ppx بواسطه‌ی پروموتور وابسته به54 σ که توسط یک تنظیم‌کننده پاسخ به نام NtrC فعال شده بود؛ کنترل شد. از سوی دیگر، در شرایط کمبود اورتوفسفات، بیان بواسطه‌ی پروموتور70 σ که توسط PhoB فعال شده بود؛ کنترل شد. نتایج بدست آمده از جهش‌یافته نول ppx نشان می‌دهند که Ppx در تولید فاکتورهای ویرولانس مرتبط با عفونت حاد (به عنوان مثال، فاکتورهای تحریک‌کننده حرکت، تولید رنگدانه آبی/ سبز، درک حد نصاب C6-C12 از طریق هموسرین لاکتون‌) و عفونت مزمن (به عنوان مثال، رامنولیپیدها، تشکیل بیوفیلم) درگیر است. روش‌های مولکولی و فیزیولوژیکی مورد استفاده در این مطالعه نشان می‌دهند که سودوموناس آئروژینوزا به طور مداوم سطوح مناسب Ppx را بدون توجه به شرایط محیطی حفظ می‌کنند. کنترل دقیق بیان ppx به نظر می‌رسد برای بقاء سودوموناس آئروژینوزا و وقوع عفونت حاد و مزمن در میزبان ضروری است.